Os cientistas se casaram com duas das técnicas de microscopia mais poderosas da atualidade para criar imagens que identificam, pela primeira vez, as identidades e localizações precisas de protea­nas individuais dentro do contexto detalhado das células bacterianas. Essas informações são cruciais para aprender como as moléculas de protea­na trabalham juntas para organizar a divisão celular e realizar outras tarefas importantes, como permitir que os micróbios farejem alimentos e perigos.

O novo manãtodo já revelou novas informações sobre protea­nas bacterianas e seus bairros celulares pra³ximos. Os pesquisadores dizem que também tem potencial para responder perguntas fundamentais sobre a maquinaria molecular de va­rus, parasitas e processos como a fotossa­ntese.

"Este éum grande salto para a biologia e acho que existem muitos sistemas que se beneficiara£o desse tipo de imagem", disse Lucy Shapiro, professora de Stanford, cujo grupo de pesquisa participou do estudo.

O novo manãtodo ha­brido, chamado de imagem correlacionada por anotação com moléculas únicas, ou CIASM (pronunciado "abismo"), foi desenvolvido por Peter Dahlberg, pesquisador de pa³s-doutorado no laboratório do professor WE Moerner da Universidade de Stanford.

a‰ uma variação de uma técnica chamada microscopia de molanãcula única de baixa temperatura, inventada por Moerner três décadas atrás, que atribui ra³tulos brilhantes a s moléculas para que possam ser identificadas individualmente. Esse manãtodo ésubjacente a  microscopia de fluorescaªncia de super-resolução, o ta³pico do Praªmio Nobel de Quí­mica de Moerner em 2014 .

O que Dahlberg fez foi encontrar uma maneira de fazer esse tipo de imagem de fluorescaªncia funcionar em temperaturas abaixo de zero, para que as mesmas amostras também pudessem ser examinadas com tomografia eletra´nica criogaªnica (CET). A CET utiliza fluxos de elanãtrons para criar imagens 3D de células congeladas por flash e seus componentes em resolução quase atômica. A combinação da TEC com a imagem fluorescente permite que os cientistas vejam as moléculas marcadas no contexto da canãlula circundante, uma perspectiva crucial para entender seu papel na maquinaria celular.

“Podemos rotular moléculas especa­ficas de interesse para que a luz que vemos venha apenas dessas moléculas e depois descobrimos onde elas estãoa cerca de 10 nana´metros ou bilionanãsimos de metro. Isso nos da¡ uma imagem muito mais precisa do que estãoacontecendo ”, disse Dahlberg. "Tiramos os instanta¢neos ultra-precisos fornecidos pela CET e adicionamos um pouco de cor".

Ele acrescentou: “a‰ emocionante desenvolver novos manãtodos de imagem. Quando vocêtermina, da¡ um passo atrás e olha para todas as novas perguntas que pode atacar. ”

Com o CIASM, a equipe de pesquisa conseguiu identificar a localização de três tipos de protea­nas nas imagens de alta resolução da bactanãria CET tiradas no Laborata³rio Nacional de Aceleradores SLAC do Departamento de Energia. Os resultados foram relatados nas Actas da Academia Nacional de Ciências hoje.

"Todo manãtodo tem suas vantagens e desvantagens", disse Moerner, "e esta éuma situação agrada¡vel, onde podemos combinar dois manãtodos para aprender mais".

Mesmo em células bacterianas relativamente simples, a localização étudo, disse Saumya Saurabh, pesquisadora de pa³s-doutorado no laboratório de Shapiro, que desempenhou um papel de liderana§a na pesquisa.

"As pessoas tendem a pensar nas bactanãrias como sacos de protea­nas sem organização", disse ele. “Mas acontece que isso não éverdade e, de fato, muitas das moléculas das bactanãrias estãolocalizadas precisamente no espaço e no tempo. Se não estiverem na posição correta, a canãlula morre. O que o trabalho de Pete finalmente nos permite fazer éolhar para dentro com resolução molecular e descobrir quando e onde essas moléculas estãolocalizadas uma em relação a  outra. ”

Caulobacter crescentus , por exemplo, uma espanãcie bem estudada de bactanãrias de águadoce, éconhecida por se dividir em dois tipos muito diferentes de células filhas: uma nada livremente, enquanto a outra forma uma haste e se liga a umasuperfÍcie. Como cada canãlula filha consegue o que precisa para seguir seu caminho aºnico tem sido um mistério de longa data.

Os cientistas já haviam identificado pequenas áreas em cada extremidade da canãlula em divisão que podem conter protea­nas que desempenham papanãis-chave nessa divisão celular desigual. Uma das protea­nas, PopZ, éencontrada nas duas extremidades da canãlula em divisão, enquanto a outra, SpmX ("Spam-X") éencontrada apenas na metade que ira¡ desenvolver um caule.

Para este estudo, Saurabh e o estudante de graduação Jiarui Wang rotularam protea­nas no  Caulobacter  com etiquetas fluorescentes. Em seguida, Dahlberg congelou essas amostras, realizou imagens de fluorescaªncia de molanãcula única com a ajuda da estudante Annina Sartor e as levou para as instalações do Stanford-SLAC Cryo-EM para imagens CET, dirigidas por Wah Chiu, professor de Stanford e SLAC.

As imagens combinadas não apenas confirmaram que ambas as protea­nas estavam nas áreas que os cientistas suspeitavam, mas também revelaram exatamente como elas estavam organizadas: o SpmX foi incorporado na membrana interna da canãlula e se projetou no interior da canãlula, onde entrou em contato direto com o PopZ.

"A orientação exata deste complexo de protea­nas foi debatida nos últimos 12 anos", disse Saurabh. “Conseguimos observar os parceiros protanãicos com uma resolução requintada. Agora temos uma imagem muito precisa de como essas protea­nas se comunicam na canãlula. ” 

A equipe testou a precisão do CIASM usando-o para confirmar a localização de uma protea­na chamada McpA, conhecida por fazer parte de uma matriz quimiorreceptora na bactanãria. "Protea­nas requintadamente sensa­veis desse conjunto servem como  o  nariz de Caulobacter ", disse Saurabh, "sentindo a química do ambiente ao redor para que possam se afastar de coisas desagrada¡veis ​​e se mover em direção a  glicose que ingerem".

A matriz aparece como linhas pretas paralelas nas imagens CET e a marcação fluorescente das mesmas imagens identificou os locais das protea­nas McpA individuais em cerca de 10 nana´metros. 

Em um estudo paralelo separado,  publicado na  Angewandte Chemie  em 24 de abril, os pesquisadores usaram uma técnica semelhante para observar pontos qua¢nticos aºnicos, com alguns resultados surpreendentes. 

Os pontos qua¢nticos são cristais em nanoescala de material semicondutor que naturalmente fluorescem em cores determinadas pelo tamanho, forma e composição. Esses pontos são usados ​​em pesquisas para rotular e rastrear protea­nas e outros materiais biola³gicos e tem aplicações potenciais em futuros eletra´nicos, iluminação, computação qua¢ntica, imagens médicas e outras áreas. 

Neste estudo, o objetivo era ver como os detalhes estruturais mais finos de pontos individuais estavam relacionados a detalhes específicos de suas propriedades a³pticas, disse Davis Perez, estudante de doutorado no laboratório de Moerner. 

"Pudemos ver alguns comportamentos surpreendentes dos pontos qua¢nticos individuais - por exemplo, em resposta a  excitação com luz laser", disse ele. "Mas o aspecto mais emocionante para mim éque o manãtodo que desenvolvemos para estudar pontos qua¢nticos também pode ser usado para estudar sistemas biola³gicos como protea­nas fotossintanãticas, onde a energia étransferida entre grupos de protea­nas e ver como a maquinaria fotossintanãtica opera". 

Moerner disse que seu laboratório estãotrabalhando com Chiu para enfrentar esses desafios.

"a‰ o começo da combinação dos dois manãtodos, e estamos entusiasmados em explorar mais colaborações ligando luz e elanãtrons", disse Chiu. "Essa abordagem de imagem ha­brida tem o potencial de descobrir estruturas de componentes moleculares envolvidos nos principais processos biola³gicos em células que abrangem todos os doma­nios da vida".

A microscopia de fluorescaªncia para este estudo foi realizada no laboratório Moerner em Stanford.