Dentro de uma única canãlula, milhares de molanãculas, como protea­nas, a­ons e outras moléculas de sinalização, trabalham juntas para realizar todos os tipos de funções - absorção de nutrientes, armazenamento de memórias e diferenciação em tecidos específicos, entre muitas outras.

Decifrar essas moléculas e todas as suas interações éuma tarefa monumental. Nos últimos 20 anos, os cientistas desenvolveram repa³rteres fluorescentes que podem usar para ler a dina¢mica de moléculas individuais dentro das células. No entanto, normalmente apenas um ou dois desses sinais podem ser observados por vez, porque um microsca³pio não pode distinguir entre muitas cores fluorescentes.

Os pesquisadores do MIT desenvolveram agora uma maneira de criar imagens de atécinco tipos diferentes de moléculas ao mesmo tempo, medindo cada sinal de locais distintos e aleata³rios em uma canãlula. Essa abordagem pode permitir que os cientistas aprendam muito mais sobre as complexas redes de sinalização que controlam a maioria das funções celulares, diz Edward Boyden, o professor Y. Eva Tan em Neurotecnologia e professor de engenharia biológica, artes e ciências da ma­dia, cérebro e ciências cognitivas em MIT.

“Existem milhares de moléculas codificadas pelo genoma e elas estãointeragindo de maneiras que não entendemos. Somente observando-os ao mesmo tempo podemos entender seus relacionamentos ”, diz Boyden, que também émembro do Instituto McGovern de Pesquisa do Canãrebro do MIT e do Instituto Koch para Pesquisa Integrativa do Ca¢ncer.

Em um novo estudo, Boyden e seus colegas usaram esta técnica para identificar duas populações de neura´nios que respondem aos sinais de ca¡lcio de maneiras diferentes, o que pode influenciar como eles codificam memórias de longo prazo, dizem os pesquisadores.

Boyden éo autor saªnior do estudo, que aparece hoje na Cell . Os principais autores do artigo são Changyang Linghu, pa³s-doutorando do MIT, e Shannon Johnson, estudante de graduação.

Para tornar a atividade molecular visível dentro de uma canãlula, os cientistas normalmente criam repa³rteres fundindo uma protea­na que detecta uma molanãcula alvo com uma protea­na que brilha. “Isso ésemelhante a como um detector de fumaa§a detecta a fumaa§a e, em seguida, acende uma luz”, diz Johnson, que também émembro do Yang-Tan Center for Molecular Therapeutics. A protea­na brilhante mais comumente usada éa protea­na fluorescente verde (GFP), que ébaseada em uma molanãcula originalmente encontrada em uma a¡gua-viva fluorescente.

“Normalmente, um bia³logo pode ver uma ou duas cores ao mesmo tempo em um microsca³pio, e muitos dos repa³rteres por aa­ são verdes, porque eles são baseados na protea­na fluorescente verde”, diz Boyden. “O que faltou atéagora éa capacidade de ver mais do que alguns desses sinais ao mesmo tempo.”

“Assim como ouvir o som de um aºnico instrumento de uma orquestra estãolonge de ser suficiente para apreciar totalmente uma sinfonia”, diz Linghu, “ao permitir a observação de vários sinais celulares ao mesmo tempo, nossa tecnologia nos ajudara¡ a entender a 'sinfonia 'de atividades celulares. ”

Para aumentar o número de sinais que eles podiam ver, os pesquisadores começam a identificar os sinais por localização em vez de cor. Eles modificaram os repa³rteres existentes para fazer com que eles se acumulassem em grupos em diferentes locais dentro de uma canãlula. Eles fizeram isso adicionando dois pequenos pepta­deos a cada repa³rter, o que ajudou os repa³rteres a formar grupos distintos dentro das células.

“a‰ como ter o repa³rter X amarrado a um bloco de LEGO e o repa³rter Z amarrado a uma pea§a K'NEX - apenas blocos de LEGO se encaixam em outros blocos de LEGO, fazendo com que apenas o repa³rter X seja agrupado com mais do repa³rter X”, diz Johnson .

Com essa técnica, cada canãlula acaba com centenas de grupos de repa³rteres fluorescentes. Depois de medir a atividade de cada cluster sob um microsca³pio, com base na alteração da fluorescaªncia, os pesquisadores podem identificar qual molanãcula estava sendo medida em cada cluster, preservando a canãlula e colorindo para marcadores de pepta­deo que são exclusivos de cada repa³rter. Os marcadores pepta­dicos são invisa­veis na canãlula viva, mas podem ser corados e vistos após a obtenção da imagem ao vivo. Isso permite aos pesquisadores distinguir os sinais de moléculas diferentes, mesmo que todas elas possam apresentar a mesma cor fluorescente na canãlula viva.

Usando essa abordagem, os pesquisadores mostraram que podiam ver cinco sinais moleculares diferentes em uma única canãlula. Para demonstrar a utilidade potencial dessa estratanãgia, eles mediram as atividades de três moléculas em paralelo - ca¡lcio, AMP ca­clico e protea­na quinase A (PKA). Essas moléculas formam uma rede de sinalização que estãoenvolvida em muitas funções celulares diferentes em todo o corpo. Nos neura´nios, ele desempenha um papel importante na tradução de uma entrada de curto prazo (dos neura´nios upstream) emmudanças de longo prazo, como o fortalecimento das conexões entre os neura´nios - um processo que énecessa¡rio para aprender e formar novas memórias.

Aplicando esta técnica de imagem aos neura´nios piramidais no hipocampo, os pesquisadores identificaram duas novas subpopulações com diferentes dina¢micas de sinalização de ca¡lcio. Uma população mostrou respostas lentas ao ca¡lcio. Na outra população, os neura´nios tiveram respostas de ca¡lcio mais rápidas. A última população teve respostas de PKA maiores. Os pesquisadores acreditam que essa resposta elevada pode ajudar a sustentarmudanças duradouras nos neura´nios.

Os pesquisadores agora planejam tentar essa abordagem em animais vivos para que possam estudar como as atividades da rede de sinalização se relacionam com o comportamento, e também expandi-lo para outros tipos de células, como as células imunola³gicas. Esta técnica também pode ser útil para comparar padraµes de rede de sinalização entre células de tecido sauda¡vel e doente.

Neste artigo, os pesquisadores mostraram que podiam registrar cinco sinais moleculares diferentes ao mesmo tempo e, ao modificar sua estratanãgia existente, eles acreditam que poderiam chegar a 16. Com trabalho adicional, esse número poderia chegar a s centenas, dizem eles.

“Isso realmente pode ajudar a abrir algumas dessas questões difa­ceis sobre como as partes de uma canãlula funcionam juntas”, diz Boyden. “Pode-se imaginar uma anãpoca em que podemos assistir a tudo o que acontece em uma canãlula viva, ou pelo menos a parte envolvida com o aprendizado, ou com a doena§a, ou com o tratamento de uma doena§a.”