Cientistas da Weill Cornell Medicine desenvolveram uma técnica computacional que aumenta muito a resolução da microscopia de força atômica, um tipo especializado de microsca³pio que "sente" os a¡tomos em umasuperfÍcie. O manãtodo revela detalhes denívelata´mico em protea­nas e outras estruturas biológicas em condições fisiola³gicas normais, abrindo uma nova janela na biologia celular, virologia e outros processos microsca³picos.

Em um estudo, publicado em 16 de junho na Nature , os pesquisadores descrevem a nova técnica, que se baseia em uma estratanãgia usada para melhorar a resolução em microscopia de luz .

Para protea­nas de estudo e outras biomoléculas em alta resolução, pesquisadores tem confiado por muito tempo em duas técnicas: cristalografia de raios-X e crio-electron microscopy . Embora ambos os manãtodos possam determinar estruturas moleculares atéa resolução de a¡tomos individuais, eles o fazem em moléculas que são estruturadas em cristais ou congeladas em temperaturas ultra-frias, possivelmente alterando suas formas fisiola³gicas normais. A microscopia de força atômica (AFM) pode analisar moléculas biológicas em condições fisiola³gicas normais, mas as imagens resultantes ficaram borradas e de baixa resolução.

"A microscopia de força atômica pode facilmente resolver a¡tomos na física, emsuperfÍcies sãolidas de silicatos e em semicondutores, então isso significa que, em princa­pio, a ma¡quina tem a precisão para fazer isso", disse o autor saªnior Dr. Simon Scheuring, professor de fisiologia e biofa­sica em anestesiologia pela Weill Cornell Medicine. "A técnica éum pouco como se vocêpegasse uma caneta e fizesse uma varredura nas Montanhas Rochosas, para obter um mapa topogra¡fico do objeto. Na realidade, nossa caneta éuma agulha afiada atéalguns a¡tomos e a objetos são moléculas de protea­na única. "

No entanto, as moléculas biológicas tem muitas partes pequenas que se mexem, borrando suas imagens de AFM. Para resolver esse problema, o Dr. Scheuring e seus colegas adaptaram um conceito da microscopia de luz chamado microscopia de super-resolução. "Teoricamente, não era possí­vel por microscopia a³ptica resolver duas moléculas fluorescentes que estavam mais próximas do que a metade do comprimento de onda da luz", disse ele. No entanto, ao estimular as moléculas adjacentes a fluorescaªncia em momentos diferentes, os microscopistas podem analisar a propagação de cada molanãcula e localizar suas localizações com alta precisão.

Em vez de estimular a fluorescaªncia, a equipe do Dr. Scheuring observou que as flutuações naturais das moléculas biológicas registradas ao longo das varreduras de AFM produzem propagações semelhantes de dados posicionais. O primeiro autor, Dr. George Heath, que era pa³s-doutorado na Weill Cornell Medicine na anãpoca do estudo e agora émembro do corpo docente da University of Leeds, envolvido em ciclos de experimentos e simulações computacionais para compreender o processo de imagem AFM em maior detalhar e extrair o ma¡ximo de informações das interações atômicas entre a ponta e a amostra.

Usando um manãtodo como a análise de super-resolução, eles foram capazes de extrair imagens de resolução muito mais alta das moléculas em movimento. Continuando a analogia topogra¡fica, o Dr. Scheuring explicou que "se as rochas (isto anã, a¡tomos) se mexem um pouco para cima e para baixo, vocêpode detectar este, depois aquele, e então vocêcalcula a média de todas as detecções ao longo do tempo e recebe alta informações de resolução. "

Como estudos anteriores de AFM coletaram rotineiramente os dados necessa¡rios, a nova técnica pode ser aplicada retroativamente a s imagens borradas que o campo gerou por décadas. Como exemplo, o novo artigo inclui uma análise de uma varredura AFM de uma protea­na de membrana de aquaporina, originalmente adquirida durante a tese de doutorado do Dr. Scheuring. A reanálise gerou uma imagem muito mais na­tida que se assemelha a s estruturas de cristalografia de raios-X da molanãcula. "Vocaª basicamente consegue uma resolução quase atômica nessassuperfÍcies agora", disse o Dr. Scheuring. Para mostrar o poder do manãtodo, os autores fornecem novos dados de alta resolução sobre a anexina, uma protea­na envolvida no reparo da membrana celular, e em um antiporter de cloreto de pra³ton, do qual eles também relatammudanças estruturais relacionadas ao seu funcionamento.

Além de permitir aos pesquisadores estudar moléculas biológicas em condições fisiologicamente relevantes, o novo manãtodo tem outras vantagens. Por exemplo, a cristalografia de raios-X e a microscopia crioeletra´nica dependem de dados de média de um grande número de molanãculas, mas o AFM pode gerar imagens de moléculas únicas. "Em vez de ter observações de centenas de molanãculas, observamos uma molanãcula cem vezes e calculamos um mapa de alta resolução", disse o Dr. Scheuring.

A obtenção de imagens de moléculas individuais durante o desempenho de suas funções pode abrir tipos inteiramente novos de análise. "Digamos que vocêtenha uma protea­na de pico [viral] que estãoem uma conformação e então éativada e entra em outra conformação", disse o Dr. Scheuring. "Vocaª seria, em princa­pio, capaz de calcular um mapa de alta resolução da mesma molanãcula enquanto ela transita de uma conformação para a outra, não de milhares de moléculas em uma ou outra conformação." Esses dados de molanãcula única de alta resolução podem fornecer informações mais detalhadas e evitar os resultados potencialmente enganosos que podem ocorrer ao calcular a média de dados de muitas molanãculas. Além disso, o mapa pode revelar novas estratanãgias para redirecionar ou interromper precisamente esses processos.